RESUMO: O gênero Mycoplasma inclui mais de 200 espécies que causam doenças nos animais. É responsável por quadros de mastite em bovinos, podendo também estar relacionado à outras manifestações como artrite e pneumonia em bezerros e novilhas. O presente estudo objetivou a detecção de Mycoplasma bovis isolados a partir de amostras de leite de mastite clínica bovina, bem como, a comparação da taxa de isolamento em dois meios de cultura: Hayflick e SP4. Para efeito de triagem amostral, foram avaliadas quanto à presença da classe Mollicutes 1166 amostras de leite de casos de mastite clínica pela técnica de PCR convencional. Das 1166 amostras de leite avaliadas, 8,6% (100/1166) foram positivas à classe. Nas análises moleculares, obteve-se 1,1% (13/1166) de positividade para Mycoplasma bovis na PCR convencional e 0,9% (11/1166) na PCR em tempo real. Os resultados do cultivo microbiológico das 100 amostras triadas previamente demonstraram 6% (6/100) de crescimento de colônias ao se utilizar o meio Hayflick e 11% (11/100) ao se utilizar o meio SP4 (incluindo as positivas ao primeiro). A partir dos 11 isolados obtidos no cultivo microbiológico, a PCR convencional confirmou Mycoplasma bovis em nove deles, e dois foram negativos para o agente. Na análise filogenética dos isolados, todos agruparam no cluster Mycoplasma bovis e Mycoplasma agalactiae. Frente aos resultados, ressalta-se a importância da presença de Mycoplasma bovis na etiologia da mastite clínica bovina e reforça a necessidade de estudos mais aprofundados para a elucidação de outras espécies de micoplasmas que possam estar envolvidas na mastite bovina.

ABSTRACT: The genus Mycoplasma includes more than 200 bacterial species that cause disease in animals. It is responsible for causing mastitis in bovines and may be related to other manifestations, such as arthritis and pneumonia in calves and heifers. The present study aimed to detect Mycoplasma bovis isolated from milk samples of bovine clinical mastitis, and to compare the isolation rates in two culture media: Hayflick and SP4. An initial screening was performed in order to detect the presence of the class Mollicutes in 1166 milk samples from clinical mastitis by the conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. According to the 1166 milk samples evaluated, 8.6% (100/1166) were positive to class Mollicutes. Regarding molecular analyses, 1.1% (13/1166) of conventional PCR for positive M. bovis was obtained and 0.9% (11/1166) in real-time PCR. The results of the microbiological culture of the 100 samples previously screened demonstrated that 6% (6/100) of colony growth have been developed when using the Hayflick medium, and 11% (11/100) when using the SP4 medium (including the positive on Hayflick medium). Concerning the 11 isolates obtained in the microbiological culture, conventional PCR confirmed M. bovis in nine of them, and two cultures were negative. In the phylogenetic analysis of the isolates, all of them were grouped in M. bovis and M. agalactiae clusters. The results confirmed the importance of the presence of M. bovis in the etiology of bovine clinical mastitis and reinforced the need for further studies to elucidate other Mycoplasma species that may be involved in bovine clinical mastitis in Brazil.

RESUMO: A mastite bovina impacta negativamente a produção leiteira e pode acarretar riscos à saúde pública. O presente estudo teve como objetivo a avaliação da qualidade do leite bovino proveniente de pequenas propriedades na região de Botucatu/SP. Foi realizada a contagem de células somáticas (CCS), identificação dos patógenos envolvidos nas mastites, e realizado o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos estafilococos isolados. Pesquisou-se a presença de genes codificadores de enterotoxinas em isolados de estafilococos obtidos a partir do leite mastítico. Amostras de leite de quartos mamários individuais de vacas foram submetidas ao “California mastitis test” (CMT) e à CCS. Das 239 vacas em lactação provenientes de 21 rebanhos leiteiros avaliados (média = 11,4 animais/propriedade), dois (0,8%) animais apresentaram mastite clínica e, 86 (35,9%) mastite subclínica. 177 amostras de leite foram cultivadas em ágar sangue bovino 5% e ágar MacConckey e obteve-se 55 (31,1%) Staphylococcus spp., 25 (14,1%) Streptococcus spp., 45 (25,4%) Corynebacterium spp. e quatro (2,3%) coliformes. A média da CCS das amostras procedentes de todos os quartos mamários infectados avaliados foi de 1598x103 células/mL, enquanto que nos casos que foram isolados Staphylococcus spp. foi de 1362x103 células/mL, Streptococcus spp. 2857x103 células/mL, Corynebacterium spp. de 976x103 células/mL e nos casos de coliformes 1161x103 células/mL. Os estafilococos revelaram grande sensibilidade (>95%) à cefalotina, cotrimoxazol, enrofloxacina e gentamicina, com resistência de 41,2% à penicilina e 11,8% à oxacilina. Tanto estafilococos coagulase positivos (ECP) como negativos (ECN) revelaram genes codificadores de enterotoxinas em 21,6% do primeiro grupo e 41,9% no segundo. O gene sea foi o mais detectado 45,8% (n=24), seguido pelo seb com 29,2% e sec com 25,0%. O gene codificador da sed não foi identificado. Frente aos resultados, destaca-se o risco potencial à saúde pública pela possibilidade de veiculação de linhagens de Staphylococcus spp. carreadores de genes produtores de enterotoxinas, podendo ocasionar toxi-infecções alimentares.

ABSTRACT: Bovine mastitis has a negative impact on milk production and can pose risks to public health. The present study aimed to evaluate the quality of bovine milk from small farms in the Botucatu/SP region. Somatic cell counts (SCC), identification of pathogens involved in mastitis, and sensitivity antimicrobial profile of staphylococci isolated were performed. The presence of enterotoxin encoding genes in isolates of staphylococci obtained from milk was investigated. Milk samples from individual mammary quarters of cows were submitted to the California mastitis test (CMT) and SCC. Of the 239 dairy cows from 21 dairy herds evaluated (mean = 11.4 animals/property), two cows (0.8%) presented clinical mastitis and 86 (35.9%) subclinical mastitis. Bacterial culture was performed in 177 quarter milk samples. Staphylococci were identified in 55 (31.1%), corynebacteria in 45 (25.4%), streptococci in 25 (14.1%) and coliforms in four (2.3%) milk samples. Average SCC from culture-positive samples was 1598x103 cells/mL, in case of staphylococci was 1362x103 cells/ml, streptococci was 2857x103 cells/mL, corynebacteria was 976x103 cells/mL and in the cases of coliforms 1161x103 cells/mL were obtained. Staphylococci showed a high sensitivity (>95%) to cephalothin, cotrimoxazole, enrofloxacin, and gentamicin, with a 41.2% resistance to penicillin and 11.8% to oxacillin. Both coagulase positive (CPS) and negative staphylococci (CNS) carried genes encoding enterotoxins in 21.6% of the first group and 41.9% in the second. The sea gene was the most detected 45.8% (n=24) between them, followed by seb with 29.2% and sec with 25.0%. The sed gene was not identified. We highlight the potential risk to public health in the possibility of strains of Staphylococcus spp. enterotoxin-producing genes that can cause staphylococcal food poisoning.

RESUMO: Este estudo avaliou por multiplex-PCR a prevalência de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli em amostras de leite de 257 caprinos (513 tetos) e dez tanques de expansão, em dez fazendas leiteiras do estado de São Paulo, Brasil. As amostras foram triadas por cultura microbiológica (padrão-uro) e testadas por diferentes protocolos multiplex-PCR para a detecção de cada bactéria. Um total de 178 amostras de leite foram positivos na cultura microbiológica, com estafilococos coagulase-negativos (70%), S. aureus (13,5%), S. intermedius (7,9%) e Enterobacteriaceae (4%) como patógenos prevalentes. Por outro lado, a PCR multiplex detectou 173 patógenos em 151/523 (28,9%, IC95% 25,2-32,9%) amostras de leite, 144/513 (28,1%) amostras de tetos e 7/10 (70%) em tanques de expansão, E. coli (86/162, 51,9%) e S. aureus (50/162, 30,9%) foram identificados nas amostras de tetos e S. aureus (6/10, 60%) e E. coli (4/5, 36,4%) em tanques expansão. Multiplex-PCR mostrou um alto desempenho para a detecção das três bactérias em leite de cabra com mastite ou em tanques de expansão. Dessa forma, este protocolo multiplex-PCR provou ser uma ferramenta adequada para a identificação dos patógenos mais comuns da mastite, independentemente de suas características fenotípicas no diagnóstico de mastite clínica em caprinos, permitindo uma vigilância contínua e melhor acompanhamento do rebanho, sendo incluído em programas de qualidade.

ABSTRACT: This study evalueted the prevalence of Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae and Escherichia coli in milk samples from 257 goats (513 half-udders) and ten bulk tanks, from ten dairy goat farms of São Paulo State, Brazil, by multiplex-PCR. The samples were screened by microbiological culture (gold-standard), and tested by different multiplex-PCR protocols for the detection of each bacterium. A total of 178 half-udders resulted positive by microbiological culture, with coagulase-negative staphylococci (70%), S. aureus (13.5%), S. intermedius (7.9%), and Enterobacteriaceae (4%) the prevalent pathogens. In other way, multiplex-PCR detected 173 pathogens in 151/523 (28.9%; CI95% 25.2-32.9%) milk samples 144/513 (28.1%) half-udders and 7/10 (70%) bulk tanks, with E. coli (86/162, 51.9%) and S. aureus (50/162, 30.9%) the prevalent ones in half-udders, and S. aureus (6/10, 60%) and E. coli (4/5, 36.4%) in bulk tanks. Multiplex-PCR showed a high performance for the detection of three bacteria at a time in mastitic goat milk direct from half-udders or bulk tanks. Thus, this multiplex-PCR protocol proved to be an adequate tool for the identification of the most common mastitis pathogens, independent of their phenotypic characteristics in the diagnosis of clinical mastitis in goats, allowing a continuous and better vigilance and monitoring the herd, being included in quality programs.

RESUMO: Propriedades da agricultura familiar tem contribuído para aumentar a produção leiteira, e podem ser considerados importantes para cadeia produtiva do leite. A higiene no processo produtivo deve ser o foco principal para garantir maior produção e qualidade do leite. Monitorou-se a qualidade do leite de vacas, em propriedades da agricultura familiar, no município de Bofete/SP, antes e após a adoção de medidas de controle. Avaliaram-se 21 propriedades, selecionadas por conveniência. Após período inicial de 13 coletas para monitoramento de CCS e CBT, os proprietários dos dois grupos (G1 e G2) receberam orientações técnicas sobre mastite e qualidade do leite, em atividade de dia de campo. Os proprietários do G1 além dessas atividades receberam intervenção no manejo utilizado, com visita técnica, e orientações individuais quanto à maneira adequada de ordenha e obtenção higiênica do leite. Posteriormente foram realizadas novas coletas quinzenais (n=12) como anteriormente, de amostras de leite de conjunto, de cada propriedade dos dois grupos, bem como do tanque comunitário. Foram consideradas variáveis climáticas como precipitação, temperatura e umidade relativa do ar. Observou-se uma variação dos resultados de cada coleta tanto para CCS/mL de leite quanto para CBT/mL de leite, nos dois períodos. Quanto a CCS no G1 houve uma diminuição significativa (P < 0,02), enquanto que para CBT houve um ligeiro aumento, bem menor, quando comparado ao valor mediano que foi de 381x103 UFC/mL de leite no G2. Os resultados medianos de CCS/mL de leite e de CBT/mL de leite do tanque comunitário foram mais elevados nas duas fases (períodos), entretanto muito superior para CBT. A análise das variáveis climáticas evidenciou aumento das medianas nos três parâmetros avaliados. A correlação entre essas variáveis e qualidade do leite, não mostrou diferenças para o Log10 da CCS e CBT. Pode-se concluir pela higiene precária no manejo de ordenha.

ABSTRACT: Family operated dairies have contributed to increase milk production and can be considered important in the milk production chain. Hygiene in the productive process must be the major focus to assure greater milk quality and production. The quality of milk from cows in family farms in the city of Bofete/SP was monitored before and after the establishment of control measures. Twenty-one dairy family farms, selected for convenience, were evaluated. After the initial period of 13 collections for SCC and TBC monitoring, farmers of the two groups (G1 and G2) received technical guidance about mastitis and milk quality during a day of field activity. G1 farmers, besides these activities, received intervention in the adopted management by means of technical visit and individual guidance as to adequate milking manner and hygienic milk production. Then, new fortnight collections (n=12) were performed, as previously, of a set of milk samples from each farm and both groups, as well as from the community tank. Climate variables were considered, such as rainfall, temperature and relative humidity. There was a variation in the results of each collection for both SCC/mL milk and TBC/mL milk in the two periods. As to SCC in G1, there was a statistically significant decrease (P < 0.02), while for TBC there was a slight increase, rather lower compared to the median value, which was 381x103 CFU/mL milk in G2. The median results of SCC/mL milk and TBC/mL milk from the community tank were greater in the two stages (periods), but much superior for TBC. Analysis of the climate variables evidenced an increase in the medians for all three evaluated parameters. The correlation between these variables and milk quality did not show differences for Log10 of SCC and TBC. It can be concluded that the milking management hygiene was precarious.

RESUMO: A mastite é considerada o maior problema dos animais destinados à produção de leite. Altera a sua composição e aumenta a contagem de células somáticas (CCS). Os micro-organismos envolvidos na doença podem ser origem infecciosa, como Staphylococcus aureus, ou ambiental, tal como Escherichia coli. A cultura bacteriana é uma ferramenta de diagnóstico e auxilia na detecção do patógeno causador da mastite. No entanto, fatores como fagocitose podem desencadear um resultado negativo. Quando estabelecido um programa de controle de mastite, o diagnóstico precoce e o início do tratamento adequado dos casos clínicos são fundamentais para se atingir os objetivos e seu sucesso, está relacionado com o patógeno envolvido. A indicação do tratamento de longa duração, ou terapia estendida, tem melhorado a resposta ao tratamento em casos de mastite por S. aureus, no entanto, com 30-50% de cura. Do ponto de vista do manejo dos animais, devido a alta contagiosidade deste patógeno, sua persistência no rebanho e custo em função ao tratamento, muitas vezes, o descarte do animal tem sido priorizado a fim de controlar os casos de mastite em propriedades. As medidas de controle são muito importantes para contribuir com a redução de casos de mastite por este patógeno. A indicação do tratamento intramamário associada com sistêmico tem poder efetivo em casos de mastite por E. coli, cujos casos agudos apresentam-se com sepse e toxemia. São abordados ainda aspectos de tratamentos alternativos das mastites, utilizados principalmente no processo orgânico de produção leiteira.

ABSTRACT: Mastites are considered a major problem on animals for milk production. Changes the milk composition and increases the somatic cell count (SCC). The microorganism involved in the disease may be infectious origin such as Staphylococcus aureus or environmental such as Escherichia coli. Bacterial culture is a diagnostic tool and aids in the detection of pathogenic causing masitis. However factor such as phagocytosis may result a negative result. When established a mastitis control program early diagnose and the initiation of appropriate treatment of clinical cases are fundamental for achieving the goals and success is related to the pathogen involved. The indication of treatment of long duration, or extended therapy has improved the response to the treatment in cases of matitis by S. aureus, however with 30-50% of cure. From the view point of handling of animals, given the high infectiousness of this pathogen, its persistence in the herd and cost-effective as a function of response to treatment often has prioritized the animal’s discard in order to control the mastitis cases in properties. Control measures are very important to contribute the reduction of cases of mastitis symptoms by this pathogen. The indication of intramammary treatment associated with systemic has power effective in cases of mastitis by E. coli, whose acute cases present with sepsis and toxemia. Also address aspects of alternative treatments of mastitis, mainly used in the organic process of milk production.

Klebsiella pneumoniae é um agente ambiental comum de mastite clínica e subclínica que afetam vacas leiteiras e pode estar presente no produto final, reduzindo a sua qualidade. Mastite causada por K. pneumoniae é ainda mais grave devido à sua má resposta à antibioticoterapia, rápida evolução para choque tóxico e morte do animal. Este trabalho teve como objetivo estudar a prevalência deste patógeno entre os rebanhos leiteiros em dez fazendas localizadas em diferentes municípios do Estado de São Paulo com base no tamanho do rebanho e uso de tecnologia de ordenha. Todas as glândulas mamárias das vacas em lactação foram examinadas usando o California Mastitis Test (CMT) e caneca de fundo telado. Foram colhidas amostras de leite (20mL) de todos os quartos CMT- positivos e dos tanques de expansão, também foram colhidos swab de fezes, membros posteriores dos animais, cama dos animais e sala de ordenha. O isolamento e identificação de K. pneumoniae foi realizada através de cultura microbiológica convencional, ensaio bioquímico e Reação em Cadeia da Polimerase, utilizando primers desenhados e testados no Laboratório de Biologia Molecular aplicada à Zoonoses (FMVZ, Unesp-Botucatu) com base na região do gene de 16S rRNA. Este estudo incluiu 1067 animais. Foram detectados seis casos de infecção intramamária por K. pneumoniae em seis diferentes animais em duas fazendas. Ainda, K. pneumoniae foi isolada em 77 swabs (34 de camas em 9 propriedades, 7 de salas de pré-ordenha em 5 propriedades, 6 de salas de ordenha em 4 propriedades, 11 do reto de animais em 6 propriedades e 19 de membros posteriores em 7 propriedades. A análise molecular confirmou o agente K. pneumoniae. K. pneumoniae foi isolada pelo menos em uma localização em todas as propriedades leiteiras., salientando a necessidade de manter a higiene nas fazendas leiteiras a fim de controlar a mastite por esse patógeno.

Klebsiella pneumoniae is a common environmental agent of clinical and subclinical mastitis affecting dairy herds, and may be present in the final product decreasing its quality. Mastitis caused by K. pneumoniae is even more severe due to its poor response to antibiotic therapy, rapid evolution to toxic shock and death of the animal. This paper aimed to study the prevalence of this pathogen among dairy herds in ten farms located in different municipalities of São Paulo State based on size and use of milking technology. All mammary glands of all lactating cows were screened using the California Mastitis Test (CMT) and a strip cup. A single aseptic milk sample (20mL) was collected from all CMT-positive quarters and bulk tanks, whereas swab samples were collected from feces, hind limbs of the animals, bedding and milking parlor. Identification of K. pneumoniae was performed using conventional microbiology culture, biochemical assay and Polimerase Chain Reaction. The primers were designed and tested at the Laboratory of Molecular Biology applied to Zoonoses (FMVZ, Unesp-Botucatu) targeting the 16S rRNA gene. This study included 1067 animals. Six cases of intramammary infection by K. pneumoniae were detected in six different cows in two farms. Moreover, K. pneumoniae was isolated in 77 swabs (34 from bedding in 9 farms, 7 from waiting rooms in 5 farms, 6 from milking parlors in 4 farms, 11 from rectums in six farms, and 19 from hindlimbs in 7 farms. Molecular analysis confirmed the agent was K. pneumoniae. At least one strain of the agent was identified in a certain site in all farms, showing the need of maintaining the hygiene in dairy farms.